ELISA实验组织提取物制备指南：从样本到可靠数据的关键第一步
ELISA（酶联免疫吸附测定）是检测组织样本中特定蛋白（如细胞因子、信号蛋白、酶等）表达水平的金标准技术之一。然而，实验的成败很大程度上取决于起始样本——组织提取物的制备质量。一份保存完好、目标蛋白完整且无干扰物质污染的提取物，是获得准确、可重复ELISA结果的基石。本文将详细介绍组织提取物的标准制备流程及关键注意事项。
一、实验前准备：安全与物料
1. 安全第一：
* 个人防护装备 (PPE)：全程佩戴实验服、一次性手套（推荐无粉丁腈手套）、护目镜。处理人或动物感染性组织时需在生物安全柜内操作。
* 锐器处理：使用专用锐器盒处理刀片、剪刀等。
* 化学品安全：熟悉所用试剂（如蛋白酶抑制剂、PMSF、DTT、离液剂）的MSDS，在通风橱中操作挥发性或有毒试剂（如PMSF）。
* 低温防护：处理液氮或干冰时，穿戴低温手套和面罩。
2. 材料与试剂准备：
* 组织样本：新鲜组织或正确保存（-80°C或液氮）的速冻组织。
* 预冷器具：研钵、研杵、匀浆器（探头式或刀片式）、离心管（1.5mL或15/50mL）、药匙、镊子、剪刀、刮刀。关键：使用前将所有接触样本的器具（包括匀浆器探头）在-20°C或冰上预冷。
* 预冷提取缓冲液：
* 基础缓冲液：常用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40或Triton X-100, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS）或更温和的NP-40缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40）。缓冲液必须4°C预冷或置于冰上。
* 关键添加剂：
* 蛋白酶抑制剂混合物：广谱抑制丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶及金属蛋白酶（如EDTA）。使用商品化混合片剂/溶液或自行配制（需包含PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂等）。
* 磷酸酶抑制剂混合物：如果检测磷酸化蛋白，必须添加（如NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸酯）。
* 还原剂 (可选)：如DTT（1-5mM）或β-巯基乙醇（1-5mM），用于打断二硫键，使蛋白充分变性溶解。
* 低温环境：冰盒或冰浴，预冷的离心机（能达4°C）。
* 液氮或干冰：用于速冻新鲜组织（强烈推荐）。
二、组织提取物制备详细流程
核心原则：全程低温、快速操作、充分裂解、去除杂质。
1. 组织取材与称重 (全程在冰上操作)：
* 新鲜组织：离体后立即置于预冷的PBS或生理盐水中短暂漂洗，去除表面血液和杂质。用滤纸吸干多余液体。快速将组织分割成小块（< 0.5cm3），精确称重（记录重量，用于后续浓度计算）。立即投入液氮或干冰中速冻，然后转移至-80°C保存，或立即进行下一步匀浆。
* 冻存组织：从-80°C或液氮中取出，避免解冻。在冰上操作，用预冷的研钵和研杵，加入少量液氮，将组织迅速研磨成细粉末（粉末状利于后续充分裂解）。在粉末即将融化前，用预冷的药匙快速将粉末刮入装有预冷裂解缓冲液的离心管中。注意：研磨过程组织必须保持冰冻状态。
2. 加入裂解缓冲液：
* 根据组织重量，按合适的比例加入预冷的裂解缓冲液。常用比例范围是 1:5 到 1:10 (w/v), 即1g组织加入5-10mL缓冲液。具体比例需根据组织类型（如脑组织需更多缓冲液）、目标蛋白丰度和实验需求优化。记录加入的缓冲液体积。
* 加入缓冲液后，立即涡旋振荡或轻柔颠倒混匀数次，确保组织粉末/小块被缓冲液完全浸没。
3. 组织匀浆/裂解 (全程在冰上操作)：
* 探头式匀浆器法 (最常用)：
* 将离心管置于冰水混合物中。
* 插入预冷的匀浆器探头，确保探头浸入液面下但避免触碰管底和管壁过猛。
* 开启匀浆器，采用间歇式匀浆（如工作5-10秒，停10-15秒，让样本冷却），全程在冰上操作。总匀浆时间通常为30-90秒，或直到无明显可见组织块。避免过度匀浆导致泡沫过多和蛋白热变性/降解。
* 匀浆结束后，用移液器吸取少量缓冲液冲洗探头，将冲洗液合并入离心管。
* 研磨法 (适用于少量或坚硬组织)：
* 在预冷的研钵中加入少量液氮和组织块。
* 快速研磨至细粉，在粉末融化前加入预冷裂解缓冲液。
* 用刮刀将混合物转移至预冷离心管。
* 在冰上持续用研杵研磨离心管内混合物数分钟。
* 超声破碎法 (辅助方法，常用于难裂解组织/细胞核)：
* 将样本置于冰上。
* 使用超声破碎仪，设置适当功率和占空比（如 30% 功率，超声 2-3秒，停 5-10秒，重复数次）。
* 严格控制时间并保持低温，避免过热。
4. 孵育裂解 (冰上)：
* 将匀浆后的裂解液在冰上孵育15-30分钟，让裂解液中的去垢剂和离液剂充分作用，释放胞内蛋白。期间可每隔5-10分钟轻柔涡旋振荡一次。
5. 离心去除不溶物 (4°C)：
* 将裂解液转移至预冷的离心管中（注意不要超过离心管最大容量）。
* 4°C, 高速离心 (通常为 12,000 - 16,000 x g)，离心 15 - 30分钟。具体时间和转速需根据样本类型和目标蛋白定位优化（如核蛋白可能需要更高转速或更长时间）。
* 目的：沉淀细胞碎片、未裂解细胞、细胞核（如果裂解液不强效）、不溶性膜蛋白、脂质等杂质。
6. 收集上清 (含可溶性蛋白提取物)：
* 极其小心地将上清液（澄清或稍浑浊的液体）吸取转移到新的、预冷的离心管中。注意：
* 切勿扰动沉淀！吸取时枪头保持在液面上层，避免接触沉淀。
* 如果沉淀不紧密或上清有漂浮物，可进行二次离心（相同条件，5-10分钟）以获得更澄清的上清。
* 此时收集的上清液即为含有可溶性总蛋白的组织提取物。
7. 蛋白定量 (BCA法或Bradford法推荐)：
* 必须对提取物进行蛋白浓度测定，以便在后续ELISA中上样等量的总蛋白。
* 使用标准方法（如BCA法或Bradford法），严格按照试剂盒说明书操作。
* 根据定量结果，可考虑用裂解缓冲液将提取物稀释至所需的工作浓度（通常0.5-2 mg/mL），方便后续ELISA加样。
8. 分装与保存：
* 将定量后的组织提取物迅速分装到小体积（如50-100μL）的预冷离心管中。
* 避免反复冻融！这是导致蛋白降解和活性丧失的主要原因。
* 短期保存：置于冰上，并在当天内进行ELISA检测。
* 长期保存：立即放入-80°C超低温冰箱。如需使用，取出后在冰上或4°C冰箱缓慢解冻，用后丢弃剩余部分，避免再次冻存。
三、关键注意事项与常见问题解决
1. 低温！低温！低温！ (重中之重)：从取材到离心结束，所有步骤尽可能在冰上或4°C环境中进行。高温是蛋白酶激活和蛋白降解的最大敌人。预冷所有试剂、器具和离心机。
2. 速度！速度！速度！组织离体后，尽快完成清洗、分割、速冻或匀浆步骤。减少室温暴露时间。
3. 蛋白酶/磷酸酶抑制剂：必须添加且足量、新鲜。抑制剂在裂解过程中会被消耗或降解。冻融或长期保存的提取物在使用前应考虑补加适量抑制剂。
4. 裂解缓冲液选择：根据目标蛋白特性（如膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白）选择合适的裂解缓冲液成分（去垢剂种类、强度、是否含还原剂、离液剂等）。RIPA缓冲液裂解能力强，但可能破坏蛋白构象和相互作用；NP-40缓冲液较温和，适合胞浆蛋白和保留相互作用。务必查阅文献或抗体说明书推荐。
5. 组织与缓冲液比例： 比例过高（缓冲液少）导致裂解不充分、粘稠、蛋白浓度过高；比例过低（缓冲液多）导致蛋白浓度过低，可能低于ELISA检测下限。需优化。
6. 匀浆强度与时间：过度匀浆会产热、起泡、导致蛋白变性和机械剪切破坏。以刚好裂解完全、无明显组织块为准。
7. 离心条件：确保离心机预冷到4°C。转速/时间不足会导致沉淀不彻底，杂质污染上清，影响ELISA背景和准确性；过度离心可能导致某些目标蛋白共沉淀损失。
8. 避免污染：使用无菌或洁净的耗材。操作时避免手、头发、唾液等接触样本和试剂。勤换枪头。
9. 分装保存：绝对避免将同一份提取物反复冻融多次。分装是保证每次使用新鲜样本的关键。
10. 记录：详细记录组织类型、重量、所用缓冲液类型/体积/批次、添加剂（抑制剂种类/浓度）、匀浆条件、离心条件、最终蛋白浓度、分装情况、保存位置等。这对结果追溯和重复实验至关重要。
11. 阳性/阴性对照：在制备实验样本的同时，制备已知表达目标蛋白的阳性组织样本和可能不表达的阴性组织（或空载体转染细胞）样本的提取物，作为ELISA实验的内部质控。
12. 样本均一性：确保同一实验组内的组织来源、处理方式、提取过程尽可能一致，减少组内差异。
四、总结
高质量的ELISA组织提取物是获得可靠数据的首要保障。严格遵守“全程低温、快速操作、充分抑制、适度裂解、彻底澄清、避免冻融、精确定量、详细记录”的原则，并针对具体实验需求优化裂解条件和缓冲液配方，是成功制备的关键。投入足够的时间和精力在样本制备环节，将极大提高后续ELISA实验的成功率和数据可信度。
